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ELISA試劑盒直接法與間接法的區(qū)別
發(fā)布時(shí)間： 2013-08-28 點(diǎn)擊次數(shù)： 1845次ELISA試劑盒可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體.在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑
1）固相的抗菌素原或抗體,即"免疫吸附劑"（immunosorbent）;
（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"（conjugate）;
（3）酶反應(yīng)的底物.根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件,可設(shè)計(jì)出各種不類型的檢測(cè)方法.
ELISA可分類是根據(jù)抗原抗體的結(jié)合情況來(lái)分類的。
主要有以下幾種類型:（直接法也稱一步法）
1 雙抗體夾心法測(cè)抗原
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體.洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì).
2） 加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng).標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì).
3） 加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng).固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合.*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體.此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān).
4） 加底物顯色.固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物.通過(guò)比色,測(cè)知標(biāo)本中抗原的量.在臨床檢驗(yàn)中,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法.如抗體的來(lái)源為抗血清,包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物.如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物.這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測(cè).
ELISA試劑盒 在一步法測(cè)定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物".類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象,此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見(jiàn)1.3.2,圖1-4）,如按常法測(cè)讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect）,因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落.鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果.因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等）時(shí),應(yīng)注意可測(cè)范圍的zui高值.用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng).
假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物.但在HBsAg的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問(wèn)題,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4個(gè)亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題.
雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾.RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合.用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng).采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾.雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)。
雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心. 2 雙抗原夾心法測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似.用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測(cè)相應(yīng)的抗體.與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體.此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法.乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法.本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法.
3 間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法.其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法
操作步驟如下:
1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原.洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì).
2）加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng).血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去.
3）加酶標(biāo)抗抗體.可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體.固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶.洗滌后,固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān).
4）加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷.間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法.間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度.雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果,但應(yīng)盡可能予以純化,以提高試驗(yàn)的特異性.特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì),例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過(guò)E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng).抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì),例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng).另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白,也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?
ELISA試劑盒 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性.病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分.IgG的吸附性很強(qiáng),非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面.因此在間接法中,抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次,以封閉（blocking）固相上的空余間隙.另外,在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200）,以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷.